Načelo eksperimenta
Namen elektroforeze hemoglobina je odkriti in potrditi različne normalne in nenormalne hemoglobine.
Zaradi različnih nabojev in izoelektričnih točk različnih vrst hemoglobina v določeni pH pufrski raztopini, ko je izoelektrična točka hemoglobina nižja od pH pufrske raztopine, hemoglobin nosi negativen naboj in med elektroforezo migrira proti anodi. Nasprotno pa se hemoglobin s pozitivnim nabojem premika proti katodi.
Pod določeno napetostjo in po določenem času elektroforeze kažejo hemoglobini z različnimi naboji in molekulskimi masami različne smeri in hitrosti migracije. To omogoča ločevanje različnih območij, na teh območjih pa je mogoče izvesti naknadno kolorimetrično ali elektroforetično analizo skeniranja za kvantificiranje različnih hemoglobinov. Najpogosteje uporabljena metoda je elektroforeza s celulozno acetatno membrano pH 8,6.
Znotraj citoplazme se skupine etilen glikola (CHOH-CHOH), ki so prisotne v glikogenu ali polisaharidnih snoveh (kot so mukopolisaharidi, mukoproteini, glikoproteini, glikolipidi itd.), oksidirajo s periodno kislino in pretvorijo v aldehidne skupine (CHO-CHO). Te aldehidne skupine se združijo z brezbarvnim škrlatno rdečim Schiffovim reagentom in tvorijo škrlatno rdeče barvilo, ki se nalaga tam, kjer so v celici prisotni polisaharidi. Ta reakcija je znana kot obarvanje s periodično kislino po Schiffu (PAS), prej imenovano obarvanje z glikogenom.
Eksperimentalna metoda
Materiali:Celulozni acetatmembrane, aparati za elektroforezo(DYCP-38C in napajalnik DYY-6C), Vrhunsko orodje za nalaganje vzorcev (pipeta), spektrofotometer, kolorimetrične kivete, medpomnilniki.
Medpomnilnik:
(1) TEB pufer pH 8,6: odtehtajte 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g borove kisline in dodajte destilirano vodo v 1000 ml.
(2) Boratni pufer: stehtajte 6,87 g boraksa in 5,56 g borove kisline ter dodajte destilirano vodo v 1000 ml.
Postopek:
PPopravek raztopine hemoglobina
Vzemite 3 ml krvi, ki vsebuje heparin ali natrijev citrat kot antikoagulant. Centrifugirajte pri 2000 obratih na minuto 10 minut in zavrzite plazmo. Rdeče krvne celice trikrat sperite s fiziološko raztopino (750 obratov na minuto, vsakokrat 5 minut centrifugiranja). Centrifugirajte pri 2200 obratih na minuto 10 minut in zavrzite supernatant. Dodajte enako količino destilirane vode, nato dodajte 0,5-kratni volumen ogljikovega tetraklorida. Močno stresajte 5 minut in nato 10 minut centrifugirajte pri 2200 obratih na minuto, da zberete zgornjo raztopino Hb za kasnejšo uporabo.
Namakanje membrane
Membrano iz celuloznega acetata narežite na trakove velikosti 3 cm × 8 cm. Namočite jih v pufer pH 8,6 TEB, dokler niso popolnoma nasičeni, nato jih odstranite in posušite s filtrirnim papirjem.
Spotting
S pipeto navpično nanesite 10 μl raztopine hemoglobina na celulozno acetatno membrano (groba stran), približno 1,5 cm od roba.
elektroforeza
Raztopino boratnega pufra nalijte v komoro za elektroforezo. Celulozno acetatno membrano s pikčasto stranjo postavite na katodni konec komore. Delajte pri 200 V 30 minut.
Izpiranje
Izrežite coni HbA in HbA2, ju postavite v ločeni epruveti in dodajte 15 ml oziroma 3 ml destilirane vode. Nežno pretresite, da se hemoglobin popolnoma eluira, nato premešajte.
kolorimetrija
Izravnajte absorbanco z uporabo destilirane vode za elucijsko raztopino in izmerite absorbanco pri 415 nm.
Izračun
HbA2(%) = absorbanca epruvete HbA2 / (absorbanca epruvete HbA × 5 + absorbanca epruvete HbA2) × 100 %
Izračun eksperimentalnih rezultatov
Referenčno območje za elektroforezo s celuloznim acetatom s pufrom TEB 8,6: HbA > 95 %, HbA2 1 %-3,1 %
Opombe
Čas elektroforeze ne sme biti predolg. Membrana iz celuloznega acetata se med elektroforezo ne sme izsušiti. Ustavite elektroforezo, ko sta HbA in HbA2 jasno ločena. Dolgotrajna elektroforeza lahko povzroči difuzijo pasov in zamegljenost.
Izogibajte se uporabi prevelikega vzorca. Prekomerna količina tekočine hemoglobina lahko povzroči odstop pasu ali nezadostno obarvanje, kar povzroči lažno povišane ravni HbA.
Preprečite kontaminacijo membrane iz celuloznega acetata z beljakovinami.
Tok ne sme biti previsok; sicer se trakovi hemoglobina morda ne bodo ločili.
Vedno vključite vzorce normalnih posameznikov in potrebne znane nenormalne hemoglobine kot kontrole.
Beijing Liuyi Biotechnology proizvaja profesionalno posodo za elektroforezo za elektroforezo hemoglobina, ki je modelDYCP-38Crezervoar za elektroforezo z membrano iz celuloznega acetata in za rezervoar za elektroforezo z membrano iz celuloznega acetata sta na voljo dva modela napajalnika za elektroforezoDYY-2CinDYY-6Cnapajanje.
Medtem Beijing Liuyi Biotechnology strankam zagotavlja celulozno acetatno membrano, velikost celulozno acetatne membrane pa je mogoče prilagoditi. Dobrodošli, da nas vprašate za vzorce in več informacij.
Blagovna znamka Beijing Liuyi ima na Kitajskem več kot 50-letno zgodovino in podjetje lahko zagotovi stabilne in visokokakovostne izdelke po vsem svetu. Skozi leta razvoja je vreden vaše izbire!
Zdaj iščemo partnerje, tako rezervoar za elektroforezo OEM kot distributerji so dobrodošli.
Če imate kakršen koli načrt nakupa za naše izdelke, prosimo, ne oklevajte in nas kontaktirajte. Lahko nam pošljete sporočilo na e-pošto[e-pošta zaščitena]oz[e-pošta zaščitena], ali nas pokličite na +86 15810650221 ali dodajte Whatsapp +86 15810650221 ali Wechat: 15810650221
Čas objave: 20. september 2023